流式细胞仪操作规程

　　关键词：流式细胞仪

　　目的：流式细胞仪开机程序、预设获取模式文件、设定和调整、样品分析、关机程序

　　一.开机程序

　　1.检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。

　　2.打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow)，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。

　　3.将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5-10分钟。排出过滤器内的气泡。

　　4.如果需要打印，打开打印机电源。

　　5.打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。

　　6.执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。

　　7.分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。

　　做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。

　　二.预设获取模式文件(Acquisition Template Files)

　　1.从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。

　　2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots(点图)。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。

　　3.选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram(直方图)。

　　4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。

　　本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。

　　三.用CELLQuest进行仪器的设定和调整

　　1.从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。

　　2.从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer(快捷键： +B)进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。

　　3.从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用 +1，2，3，4获得此四个对话框。

　　4.在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode)：线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSC和SSC多以线性模式Lin测量，且DDM Param选择FL2，而FL1, FL2与FL3则以对数模式Log测量;分析细胞DNA含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Lin进行测量，且DDM Param选择FL2;分析血小板表型时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3等均以Log进行测量。

　　5.放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。

　　6.在Acquisiton Control对话框中，选取Acquire，开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取Pause，Restart以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“”。

　　7.在Detectors/Amps对话框中，调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMT voltages(粗调)与Amp Gains(细调)，使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布。

　　8.在Threshold 对话框中选择适当的参数设定Threshold，并调整Threshold的高低，以减少噪音信号(细胞碎片)。一般做细胞表型时用FSC-H而做DNA时用FL2-H。Threshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。

　　9.从屏幕左列绘图工具中选取Region(区域)，并在靶细胞周围设定区域线，即通常所说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。

　　10.Detectors/Amps对话框中，调整荧光检测器(FL1, FL2, FL3, FL4等)的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。

　　11.在Compensation对话框中，根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色(或多色)荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为FL1+ FL2- 的细胞群却分布在FL1+ FL2+区域内，则需调大FL2-?%FL1中的“?”，并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当

　　12.在Status对话框中可见：Laser Power:正常值—Run/Ready为14.7mW，Standby为5mW;Laser current:正常值为6Amps左右。

　　13.调整好的仪器设定可在Instrument Settings对话框中储存，下次进行相同实验时可调出使用，届时只需微调即可。

　　本计算机中已有三个名叫储存于FACStation G3 \BD Applications \CELLQuest Folder \IMM-InstrSettings及FACStation G3 \BD Files \Instrument Settings Files \CalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件，前二者可用于分析人白细胞，后者用于分析小鼠肥大细胞。

　　四.通过预设的获取模式文件进行样品分析

　　1.从苹果标志中选择CELLQUEST，新视窗出现后从File指令栏中选择Open，打开预设的获取模式文件。

　　2.从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。

　　3.从Cytometer指令栏中选取Instrument Settings，在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定，按Set 确定。

　　4.在Acquire指令栏中，选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数，参数，信号道数。其中Resolution在做细胞表面标志时选择256，做DNA时选择1024。Parameter Saved…则根据不同的检测对象选择不同的参数。

　　5.在Acquire指令栏中，选择Parameter Description，以决定文件存储位置(folder)，文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记(panel)，即安排tube1，2，3…的检测参数。一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \IMM 和DNA 文件夹中。文件根据日期命名。

　　6.在Cytometer指令栏中，选择Counters，将此对话框移至合适位置，以便于随时观察events计数。

　　7.将样品试管放至检测区，在Acquire Control对话框中选取Acquire以启动样品分析测定。

　　8.微调仪器设定，待细胞群分布合适后选择Acquire Control对话框中Pause, Abort, 去除Setup前的“”，开始正式获取信号，存储数据。

　　9.当一定数目的细胞被测定后，获取会自动停止，并会自动存储数据。重复步骤7，继续分析下一个样品，直到所有的样品数据分析完毕。

　　当所有样品分析分析完毕，即换上三蒸水，并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态，以保护激光管。

　　五.关机程序：

　　1.从File中选择Quit, 退出软件，选择Don’t Save至苹果屏幕。

　　2.用4ml 1：10稀释的漂白水作样品，将样品置于旁位(vacuum is on)，以外管吸去约2ml，在将样品架置于中位(vacuum is off)，再HIGH RUN 5分钟(内管吸去2ml)。

　　3.改用三蒸水4ml作样品,同上处理。

　　4.按Prime三次。

　　5.此时仪器自动转为STANDBY状态，换2ml三蒸水。必须在仪器处于“STANDBY”状态 10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源，以延长激光管寿命，并确保应用软件的正常运行。

　　6.填写使用登记表。