从实验台到临床的质谱成像技术

　　“人类天生就可以收集大量的视觉信息。”范德堡大学医学院斯坦福·摩尔生物化学主任与质谱研究中心主任 Richard Caprioli 表示，“我们喜欢图样、我们喜欢照片，我们通过一张简单的照片可以获得大量的信息。”

　　在 Caprioli 看来，这一点解释了质谱成像技术(MSI)为什么越来越受欢迎。尤其是这项技术可以帮助组织学家获得原本需要数年才能掌握的专业知识。“它采用的不是颜色维度，而是分子维度。但这个事实并不是那么重要，只要分子维度有足够的信息量。”他说。

　　质谱成像技术就像是免疫组织化学的高通量版本，只是没有抗体而已。质谱成像技术并没有为组织切片事先染上特殊标记，它使用质谱仪一次性挑选并绘制成百上千种分子的空间排列。研究者无需提前知道哪个分子比较重要，就可以利用该技术进行绘制挑选，而且速度很快。“我们的仪器有激光，每秒可以做 5000 个质谱。” Caprioli 表示，这一速度足以在一个小时之内扫描包括数百个病患活组织在内的组织微阵列整体。

　　但是，质谱成像技术的应用也存在明显的障碍。比方说，图像分辨率随着光点尺寸的减小而升高，但却降低了离子材料的产量。该技术并没有初步分离的步骤，因此可能会只抽取丰度最高的分子。而在计算方面，研究人员面临的挑战则是如何对数据进行分析，特别是如何能够真正理解这些数据。但是不管怎么说，研究人员正在使用质谱成像技术进行研究，无论是确定亚细胞分辨率下组织切片中的药物代谢产物，证实疾病的生物标记，还是鉴别肿瘤的边界等等。他们甚至正在将该技术引入临床，至少是接近于临床研究。

　　质谱成像技术的策略

　　那么，什么是质谱成像技术?就像是一张标准的数码照片，数字成像的色彩是通过红绿蓝 3 个颜色通道叠加而成的，屏幕上每个小像素的颜色都是由这三个颜色的密度所构成的。

　　现在，想象一张拥有成千上万个颜色通道的图片。这就是质谱成像技术， Caprioli 说，每个通道都是你想要展示的那个分子种类或质谱峰。研究人员将这些不同的通道互相覆盖，便可以产生一个针对组织分子构成和空间分布的彩色绘图，无论是对蛋白质、神经肽、代谢分子还是脂类等组织——显然脂类的需求正在增加。

　　研究人员为质谱成像技术设计了几十套方案，但正如 2012 年的综述中所说的(J. Proteomics, 75:4883, 2012)，只有三种是最常见的。 Caprioli 的基质辅助激光解析质谱成像技术(MALDI-MSI)通过紫外线激光光栅扫描一个基质包膜的组织切片来建立图像。该技术的像素大小一般近似于 1 到 10 个微米，意味着它可以达到亚细胞分辨率。但由于它需要使用 MALDI 基质和真空环境，所以 MALDI-MSI 不适用于活体样本。同时，基质是用来吸收激光能量并转移到样本上去，但是这种基质可能会很难在样本上操作并产生大量的小分子量的电离物，这会遮蔽生成光谱的代谢区域。

　　宾夕法尼亚州立大学埃文·普名誉化学教授 Nick Winograd 采用了第二种方法——次级离子质谱法(SIMS)。这种方法通过在样品表面喷镀离子束让样品产生电离作用(比方说，英国 Ionoptika 公司的带电 C60 分子或氩团簇束)，不使用激光。 Winograd 称，这种方法有两大优点，第一个是分辨率：SIMS得出的像素约有 300 纳米，而MALDI充其量只有1毫米。另一个是通过分子深度剖析，研究人员可以使用碰撞而成的坑痕去“深挖”这个样本，通过三维立体化绘制其分子组成物。

　　第三种是电喷雾解析电离技术(DESI)，这种(非真空的)电离技术通过喷射溶剂，将溶剂覆盖在未经处理的组织表面上，溶解表面的分子。然后再继续往上滴溶剂，以使溶解物溅到质谱仪上，进行电离和分析。(Prosolia 公司对 DESI 技术进行商业化，该公司由该技术的发明者、普度大学化学家 R. Graham Cooks 共同创办。)

　　DESI、MALDI、SIMS 这三种技术以及他们的变体都采用阿姆斯特丹 FOM 研究所 AMOLF 学院 Ron Heeren 所谓的“微探针”模式，分辨率随着像素尺寸减小而升高。这里面的问题是如何从尽可能小的光点中最大化样品的电离作用。但是较小的光电也就意味着检测到的离子会更少，且不要说成像时间会更长了(因为里面的像素会变多)。

　　Heeren 更喜欢“显微”模式。这种模式可以用散焦像素更快成像，再加上像素检测器如 CCD，可以有效地一次性捕获 262144(512x512)个光谱。

　　“这就像个相机。” Heeren 解释道，“就是一点，我们制造的是分子闪光照片。”

　　Heeren 认为这个“质谱显微镜”的关键是 Timepix 探测器，这个探测器是CCD和飞行时间质谱分析器的结合。(Heeren 共同创立的 Omics2Image 拥有 Timepix 探测器)。他解释，大多数质谱检测装置将探测器视为一个大的像素，将所有到达表面的离子碰撞整合为一个单一的信号。 Timepix 将这个信号分成 262000 个空间分辨的点，这样在探测到成像表面分子时，它们可以保持并记录自己的空间定位，成像速度非常快。

　　有多快? Heeren 说， MALDI-MSI 仪器可以产生每秒钟一个像素，达到一微米的分辨率。因此在一个 100x100 毫米的区域中，要想生成 1 万个像素需要花费 2.7 个小时。但使用质量显微镜和 Timepix 探测器，“我们可以在一秒钟内得到这些信息。”

　　显微镜上还有物理电子学 TRIFT SIMS-TOF 系统，上面还有一个 MALDI 技术， Heeren 团队最近正在使用这一技术探索骨关节炎下的生理变化。“我们甚至可以证实，在蛋白质水平和脂代谢水平上的生理变化以及软骨矿化，会导致软骨机械强度的流失。”他说。

　　常态MSI

　　与 MALDI 和 SIMS 相比，DESI 和激光烧蚀电喷雾技术(LAESI，由 Protea Biosciences 推出的激光技术)这些正常大气压下的电离技术拥有一些特殊的优势。最明显的优势是，他们不需要进行样品处理，在正常空气中操作即可，不需要真空。因此，他们可以用在活体样本上，甚至可以在患者身上进行操作。

　　“我自己这辈子的追求就是：用未处理过的样品就可以进行质谱分析。”这是 Cooks 几十年来的目标。

　　作为一个研究者， Cooks 的工作是提取并测定植物生物碱的结构。很长的一段时间内，研究都非常艰辛，他只提取了一点“不纯的生物碱，而且也没有做出结构方面的进展”。直到他遇到了从斯坦福大学来演讲的Carl Djerassi。他说，Djerassi把他的材料样品带回了实验室，并收集它们的质谱，十天后又把结构发了回来。“这让我相信质谱分析法的强大。” Cooks 说，“同时，我也发现提取方法学中存在的局限性。”

　　从那以后，他开始从那些在生物上不怎么好操作的技术限制中脱出来，进行质谱分析，发展了正常气压下的电离技术，特别是 DESI。2011年，由 Cooks 和哈佛医学院Nathalie Agar 共同领导的团队，使用电喷雾解析电离质谱技术(DESI-MS)来存储脑肿瘤组织，使用脂类特征检测结果帮助电脑区分不同形式和组织病理学分级的神经胶质瘤(一种脑瘤)。

　　对于这种分析来说，脂类是一个古怪的选择。的确，脂类对于 MSI 从业者来说就是无奈之举，但他们必须从中获取最大的价值。在标准的细胞分析中，研究人员可以分离细胞提取物，并去掉不想要的部分，这其中往往就包括脂类。但是在MSI及其他原位应用中，研究人员必须知道自己面前摆着的是什么。他们面前摆着的主要是脂类。但幸运的是，脂类不仅丰度高，非常容易电离，而且信息量也很大。

　　“如果你只看脂类的话，它的组织特征比蛋白质要好得多。”伦敦帝国学院医疗质谱部门研究员 Zoltán Takáts 这样说。

　　最近， Cooks 和 Agar 将这一方法应用到5个正在进行治疗的脑癌病人的 32 个手术标本当中。该系统通过逐个像素报告了肿瘤的亚型、分级以及癌细胞的部分。 Cooks 说，这些数据可以让他们的团队在绘制肿瘤边界时找出不同组织病理学级别的各个区域，补充MRI数据。他还强调，他们使用的是“最便宜的”质谱分析仪器，Thermo Fisher 公司的单级(与串联相对)低分辨率 LTQ 离子阱。

　　但 Agar 也指出，这还是一个研究项目，团队不能实时将这些结果传递给外科医生，他们在波士顿收集样本，但真正成像却是在印第安纳州。自那以后，她的团队在布莱罕妇女医院的 AMIGO 手术室安装了 Bruker 公司利用 DESI 技术的 amaZon Speed 离子阱，用来进行脑瘤案例的测试。该手术室是医院的影像引导治疗国家中心。 Agar 说，很快他们会研制出乳腺癌测试，但是团队仍然不能指导外科医生真正操刀。这种方法首先必须经过验证，“这最终会需要经过临床试验进行验证。”

　　简化数据分析

　　最终，要想把 MSI 推向临床，就必须要跨越质谱仪专家，让真正需要使用它的人掌握这门技术。然而，没有几个临床医生能够掌握 MSI 技术、数据处理和信息学的精妙，而且更没有人愿意花时间学习了。在 Cooks 看来，如果这项技术“又娇贵，而且这项质谱技术需要博士才能掌握”的话，就很难进行推广，“它需要全自动，仪器也不能那么娇贵，必须要可靠而且相对简单。”

　　对于典型的组织病理学应用来说，这不是什么问题，因为这个系统可以配置成智能盒子(turnkey boxes)，只有通过特定的生物标记才能打开。全球的各大临床实验室已经在常规地使用非成像质谱仪，包括 Bruker 公司的 MALDI BioTyper 和 Sequenom 公司 MassARRAY。 Caprioli 想要为组织学家和病理学家设计一款类似于显微镜的 MSI，仪器小到甚至可以塞在桌下。实验室技术员只需要学会如何准备样本、操作机器，软件就可以进行剩下的操作。

　　但是像生物标志物鉴定等更为复杂的应用则是另一回事儿。“质谱成像技术数据集的大小取决于图像像素的数量和质谱仪的分辨率。而近年来，它俩发生了巨大的变化。”劳伦斯-伯克利国家实验室科学家 Ben Bowen 说，他发明了质谱成像技术的数据分析软件。

　　随着分辨率的提高，像素就会收缩。同时，进行“发现模式”实验的研究人员预先不知道哪个分子更为重要，所以他们要将所有分子都考虑进去，在成千上万个颜色通道上进行两两比较。

　　所有这些像素加起来的数据是惊人的。 Bowen 说，他的同事 Trent Northen 在自己的工作中使用质谱成像技术，这些年已经收集了几百万兆字节的数据。对于初学者来说，打开数据文件都是个问题，这让他们非常依赖更精通于这项技术的专家。“你就会知道为什么它让这些科学家如此不悦了。” Bowen 说。

　　为了减轻他们的负担， Northen 和 Bowen 与伯克利实验室数据可视化专家 Oliver Ruebel 一同研发了 OpenMSI 的云计算平台，用户可以直接在浏览器上浏览和操作质谱成像技术的云计算数据。 Bowen 介绍，美国能源部国家能源研究科学计算机中心(NERSC)的超级计算机用于支持该系统，将数据处理时间从几天减少到几分钟。

　　Bowen 说，他和 Northen 的合作者之一可以使用 OpenMSI 详细研究 50 千兆字节的数据集，这个数据集他在一年半前就收集到了，但是一直没有办法进行研究。“现在他就在(谷歌)浏览器中使用这项技术。”他举例说，包括浏览RGB图像，检验下面的光谱，并与同事分享数据，“所有你能想到的 21 世纪互联网所提供的功能，我们都能在 OpenMSI 上实现质谱成像技术的这一功能。”

　　手术室的质谱仪

　　但是要想达到临床可译性的最优化，研究人员可能必须要脱离MSI的成像部分。这就是伦敦帝国学院 Takáts 的研究成果。

　　Takáts 是 Cooks 之前的博士后，作为论文第一作者首次对 DESI 进行描述。他研发并正在检测一种新的非真空电离技术——快速蒸气电离质谱仪(REIMS)，并设计了 iKnife 智能手术刀，外科医生可以在手术室就搞定组织的组织学和组织病理学问题。

　　“最终的设备非常简单。” Takáts 解释道，而且还依赖电外科技术，这种切割技术使用电流气化组织。这个过程释放的烟雾是焦油、微粒物质和电离脂质的组合，iKnife持续提取样本放入附在旁边的聚四氟乙烯管，然后放入质谱仪。

　　在过去几年内， Takáts 建立的数据库包括了近 20 万人类癌症和健康组织的脂类样本。通过这些数据，他证实了可以通过脂类生物标记区别不同的样本。因此，使用在电外科过程中产生的离子化的脂类特征，他的系统可以基本上实时地确定iKnife下面的组织是健康的还是癌变的，以及其组织学状态。

　　但要说明的是，这里面没有成像。“出来的诊断结果是组织学水平的鉴定。” Takáts 说，“这个系统会告诉你这是非小细胞肺癌，2 期之类的。”

　　在匈牙利、德国和英国，iKnife(MediMass 公司和帝国学院的研发成果)已经在超过 500 个手术中进行检测，“在绝大多数案例中，能够达到 100% 的分类正确率。” Takáts 说，涵盖了胃肠道癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和脑癌。在有些案例中，医生本以为是肿瘤，但是该技术却证明只是良性组织或炎症性疾病。现在， Takáts 正在研发一种新的系统，可以为内窥镜检查进行类似的评估。

　　Takáts 表示，最终，这种应用可能会让 MSI 变得“意义非凡”，不仅是作为一个研究工具，更是作为常规的临床技术。他指出，组织病理学研究者可能不愿意接受这种相对较慢、而且价格高昂的技术。但他也表示，是这款仪器的速度和价格都会有所改善。以往，要想进行这项检测，最好的时机是要在解剖后等待半个小时才能进行检测。如果这项技术能够医生在几秒钟内提供诊断，并且是体内的，那么人们就会更倾向于这项技术。

　　“这套系统的优势是组织病理学所不能及的。”他说。