广州生物院发表干细胞新成果

三月二十日，来自中科院广州生物医药与健康研究院、武汉菲沙基因信息有限公司(Frasergen)和加拿大西蒙佛雷泽大学的研究人员，在国际著名学术期刊《Journal of BioLogical Chemistry》发表学术论文，该研究检测了iPSC生成及随后基因校正过程中的基因组不稳定性，指出重编程和基因打靶可能会产生大量但却不同的基因组变化，因此，在iPSC诱导时及基因打靶之后，必须进行严格的基因组监控和选择。

本文通讯作者是中科院生物医药与健康研究院研究员潘光锦博士，其2002年硕士毕业于山东医学科学院，2005年博士毕业于清华大学医学院，随后在美国威斯康星大学-麦迪逊从事博士后研究，2010年至今为中科院广州生物医药与健康研究院研究员。主要从事人胚胎干(ES)细胞多能性及自我更新的分子生物学调控和人诱导性多能干(iPS)细胞的形成及临床应用的可行性实验室研究，研究成果曾经发表在Cell、Cell Stem Cell、FASEB J、JBC等国际学术期刊。

人体诱导多能干细胞(iPSCs)，可以进行无限的自我更新，同时又保持产生体内所有类型体细胞的潜力，从而为发育生物学研究、疾病模型，以及在再生医学上的应用开辟了新的途径。将iPSCs生成与靶向基因组编辑相结合，的确已被用于构建各种遗传疾病的模型，包括β-Thal。

β-Thal是世界上最常见的一种遗传性疾病，患者患有严重贫血，需要定期输血。这种疾病是由β血红蛋白基因(HBB)突变或缺失引起的，可破坏正常红血细胞的功能。目前，从健康供体移植骨髓，是治愈β-Thal的唯一方法，但这种治疗受到人类白细胞抗原(HLA)匹配供体缺乏的限制。

从理论上讲，在突变HBB靶向基因组校正后从β-Thal患者生成iPSCs，可能是这些疾病一种理想的新疗法。最近开发的基因组编辑工具，如锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样核酸酶(TALENs)和聚集调节间隔短回文重复(CRISPR)/Cas9为基础的RNA引导DNA内切酶，大大提高了人类iPSCs或ESCs的基因打靶效率，从而能够生成个性化的、基因校正的iPSCs用于细胞治疗。然而，重编程和随后的基因打靶步骤，是否会生成有害的的基因组变化，在这种类型用细胞治疗用于临床实践之前还需要进行评估。

产生基因校正的iPSCs ，需要因子诱导的体细胞重编程和核酸酶辅助的基因打靶步骤。重编程或基因打靶技术对基因组稳定性的影响，已经吸引了诸多关注。例如，据报道，iPSCs比其他细胞系(比如ES细胞或体细胞)携带更频繁的CNVs。这些CNVs中的一些确实归因于细胞重组过程。然而，另一项研究报道了极少数的核苷酸水平变化，如非同义SNVs和INDELS，在通过非病毒方法产生的iPS细胞中被发现。同样，基因组编辑工具(如TALENs或CRISPR/cas9)对基因组稳定性的影响也被分析过。一般来说，基于全基因组测序数据，这些基因组编辑工具似乎没有引起太多的基因组变化，表明这些工具应用于临床可能是安全的。

这项研究的目的是，通过基因校正的β-Thal iPSCs产生过程，检测所产生的基因组变化，包括通过非病毒方法、克隆选择、扩增、基因组编辑和外源基因切除的iPSC生成。首先，研究人员用携带HBB第二内含子(位点654)纯合点突变的羊水细胞，生成了一个非整合型的β-Thal iPSC细胞系。

然后，研究人员通过ZFN辅助的基因打靶和外源耐药基因切除，校正了两个突变的HBB等位基因，以获得最终的HBB校正iPSCs。接下来，研究人员对亲代细胞进行了连续的CGHs和外显子组测序。

这些研究结果表明，即使用非病毒方法，iPSC诱导也可能会产生一定数量的变化，包括CNVs和SNVs。同时，随后的ZFN辅助基因打靶会造成可以忽略的CNVs，但是更多的SNVs。分析结果表明，因素诱导的体细胞重编程和ZFN辅助的基因打靶，往往会产生不同的基因组变化。在个性化基因校正iPSC细胞治疗应用于临床之前，需要对这些变化进行仔细的分析和评估。