化学发光免疫分析及其进展

　　摘要：

　　化学发光免疫分析是将化学发光与免疫分析方法相结合，综合了化学发光的高灵敏度和免疫分析的高选择性，被广泛应用到临床检测和药物分析中。随着新的发光试剂，新固相材料的研制以及新标记技术应用，化学发光免疫分析方法的灵敏度，重现性将大大提高。

　　在分析化学中，化学发光是当基态分子吸收化学反应中释放的能量跃迁到激发态，处于激发态的分子以光辐射的形式返回到基态时产生的光。基于化学发光强度和被测物含量之间的关系建立的分析方法叫化学发光分析法，化学发光与高效液相色谱、毛细管电泳、免疫分析等技术的结合，具有灵敏度高，线性范围宽，仪器简单、操作简便等特点，已广泛地应用于环境、临床、食品和工业分析中。将化学发光与免疫分析方法相结合，综合了化学发光的高灵敏度和免疫分析的高选择性，近年来，成为研究的热点。

　　1化学发光免疫分析的分类

　　化学发光免疫分析根据发光体系应用于免疫分析中的方式不同可分为：直接标记发光物质的免疫分析、酶催化化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析。

　　1.1直接标记发光物质的免疫分析

　　该方法是用化学发光剂直接标记抗原或抗体。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物，是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂的作用而发光，强烈的直接发光在1S内完成，为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无需催化剂;检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低;与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。张皓等采用直接化学发光技术进行的全自动双抗夹心免疫测定方法，对130例患者测定血清B—HCG含量法。用化学发光免疫分析法检测.HCG，操作简便、敏感度高、特异性强，优于一般的酶联免疫法和放射免疫法，适合于临床实验室推广使用。

　　1.2酶催化化学发光免疫分析

　　从标记免疫分析角度，酶催化化学发光免疫分析应属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，操作步骤与酶免疫分析完全相同：以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)，它们有各自的发光底物。辣根过氧化物酶常用的底物为鲁米诺或其衍生物如异鲁米诺，鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧(过氧化阴离子、单线态氧、羟自由基、过氧化氢)存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nln。钮心怡等采用特异性的两株C.P单克隆抗体，辣根过氧化物鲁米诺酶促增敏化学发光体系，利用双抗体夹心法检测。敏感度为0.102 g/L;检测线性范围为0.102～20 L;多人次检测证实试剂盒批内变异均小于10%，分析间变异小于15%;与18 g/L人胰岛素原、2000mIU/L的人胰岛素无显著交叉反应。

　　碱性磷酸酶所用底物为环1，2.二氧乙烷衍生物用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团——金刚烷基，其分子中发光基团为芳香基团和酶作用的基团，在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。冯艳铭等_3』采用双抗体异位点一步夹心法，以甲胎蛋白单克隆抗体作为固相包被，采用改良过碘酸钠法进行甲胎蛋白多克隆抗体与碱性磷酸酶偶联制备酶标抗体;以金刚烷胺衍生物CSPD作为底物，优化CSPD与SapphireII发光体系用国家标准品校定定量标准品，建立了人血清AFP的化学发光免疫定量分析法。利用化学发光酶免疫分析方法，以碱性磷酸酶作为标记物，环1，2一二氧乙烷衍生物AMPPD为发光底物，测定血清中的糖抗原50，检出限为1.0umL～，线性范围为0～300umL一。

　　批内精密度<7%，批内精密度为11%。

　　1.3电化学发光免疫分析

　　电化学发光免疫分析的反应在电极表面进行，发光底物为三联吡啶钌，用另一反应物三丙胺来激发光反应。在阳极表面，这两种物质可同时失去电子，发生氧化反应。在电极板上二价的三联吡啶钌迅速被氧化成三价三联吡啶钌，与此同时三丙胺也在电极板上被氧化成三丙胺阳离子自由基，三丙胺阳离子自由基自发地释放一个质子而变成三丙胺非稳定分子，将一个电子递给三价三联吡啶钌，形成激发态的二价三联吡啶钌。激发态的二价三联毗啶钌在衰减的同时发射一个波长为620/l/n的光子，重新回到基态二价三联吡啶钌。这一过程在电极表面反复进行，产生高效、稳定的连续发光，并不断增强。张继东用电化学发光免疫分析法在检测乙肝标志物，发现用电化学方法检测，灵敏度更高，专属性更强。

　　2新进展

　　化学免疫分析方法的新进展主要表现在新的标记物以及标记技术的应用，新型固相载体的应用以及联用技术。

　　2.1新的标记物

　　近年来，科学家们致力于化学发光物质的研究，通过往发光体系中加入增加化学增强剂来增加量子产率以及发光时间。同时一些学者将目光集中于新的标记发光物的开发中。并取得了相应成果。目前已证明从棕榈树和大豆中提取的HRP的阴离子型同工酶(HRP2A)在没有增强剂的情况下可以高效、常时间催化luminol—H2O2体系发光，并且HRP.A比HRP—C稳定性更好，这在酶标记物的储存中是非常重要的。而白细胞碱性磷(Leukocyte Alkaline Phosphatase，LAP)与AIJP一样，也有催化性能，并已用于化学发光的检测。此外，还通过合成技术合成了吖啶酯类化学发光试剂。Zhuang等合成了一种新型双吖啶化合物：1O，102二甲基23，32二磺基29，9’2二双吖啶(DMDSBA)，并详细研究了它的化学发光性质。DMDSBA被用于标记抗一CEA抗体。标记的比率接近1.15～1.32，平均标记比例是1.25。结果表明，连接到抗一CEA抗体后，标记抗体的免疫反应活性与DMDSBA的量子效率没有明显改变。建立了一种新的夹心化学发光免疫方法，测定人血清中CEA的线性范围为1.0～100ng/mL，检测限0.53ng/mL。

　　2.2新标记技术的应用

　　固相标记方法的应用，减少游离标记物以及聚合蛋白质;纳米技术与生物分析的结合，即利用Au、Ag等阳离子对化学发光具有催化放大作用，提高检测灵敏度。HonglanQ等利用电化学发光免疫分析方法，将N.氨丁基一N.异鲁米诺(ABEI)作为发光标记试剂标记在金毫微粒改性的石蜡活化的石墨电极上，测定人体[gG。电化学发光的强度大大增强，ABEI检出限为2×10-14 mol/L(S/N=3)，lgG的检出限为1×10。g/mL(S/N=3)。线性范围为3.0×10-ll～1.0×10-9g/mL。在浓度为1.0×10-10/mL时的RSD为3.1%。说明金微粒化学发光的催化放大作用在化学发光免疫分析方法中有很大的应用前景。量子点(quantumdots，QDs)又称半导体纳米微晶体，是一种由Ⅱ.Ⅵ族或Ⅲ.V族元素组成的能够接受激光产生荧光的半导体纳米颗粒，直径约为2～6nm。与CLIA常用标记酶和荧光素相比，QD不易失活，受外部环境影响小，性质稳定，重现性好激发光谱范围宽，而发射光谱窄且对称，是不可多得的标记物。

　　2.3新固相材料的应用

　　新固相材料主要体现在(1)表面有与蛋白结合的官能团，可以充分固定抗体抗原;(2)表面性质要保证不影响结合后蛋白的免疫反应活性;(3)比表面积要足够大以固定足够量蛋白(4)应具有亲水性以避免与待测物和样品基质的非共价结合;(5)在载液的冲击下保持表面的抗体结合活性。目前用于丌.的固相材料主要有尼龙、琼脂糖凝胶、磁性粒子，以及二氧化硅可控孔度玻璃(Controlled poreglass，CPG)和玻璃微珠_IJ等有机硅材料。

　　2.4与其他技术联用

　　目前研究最多的是毛细管电泳一化学发光免疫分析技术(CECLIA)结合了CE对生物样品分离的高效分离和CLIA的高灵敏度检测。王军华等利用毛细管电泳免疫化学发光检测鼠血管平滑肌细胞中zmol骨形成蛋白.2，采用辣根过氧化物酶(HRP)催化鲁米诺.过氧化氢，以对碘苯酚增强其化学发光反应，HRP检出限为4.4pmol/L(53zmo1)，是目前报道检测HRP的最高灵敏度之一。用毛细管电泳化学发光免疫方法测定了人血清中乙肝表面抗原和抗体，并与酶免疫分析方法比较，验证了毛细管电泳化学发光免疫技术用于临床的可行性。流动注射化学发光免疫技术流动注射化学发光分析技术是将化学发光分析和流动注射相结合的一种高灵敏度的微量及痕量分析技术，其分析速度快、器设备简单，是当前分析化学领域中研究的热点。利用顺序流动注射技术分析非离子型表面活性剂，线性范围0～1000ppb，最低检出限为10ppm每个样品的分析时问为15min，已经被成功用于河水中anti-ApnEOs的检测。

　　3结语

　　化学发光免疫分析方法作为一种高选择、高灵敏度检测方法，已经被广泛应用临床检测和药物分析中。随着新的发光试剂，新固相材料的研制以及新标记技术应用，化学发光免疫分析方法的灵敏度，重现性将大大提高。各种联用技术的出现，如毛细管电泳一化学发光免疫技术的联用，大大提高了化学发光免疫的选择性和重现性。被广泛应用于临床检测和药物分析中，并朝着自动化、智能化、微型化方向发展。