快速实时的PCR检测---赛多利斯实验室

快速实时的PCR检测---赛多利斯实验室

支原体是世界上最小的能够独立繁殖的细菌之一。它们属于柔膜细菌目（Mollicutes），具有非常缓慢的寄生生长方式。支原体可引起动物和植物体内的众多感染现象。

快速实时的PCR检测

用于支原体DNA敏感检测的实时PCR技术

本文以使用Vivaspin® 20 超滤管进行DNA分离，用Microsart® AMP进行支原体检测为例。基于PCR的检测试剂盒为用户提供可靠、稳定的检测结果，耗时只需3小时，该方法简易且经济、即取即用、灵敏度高。

支原体没有细菌所具有的细胞壁，也就没有抗体的攻击点，因而非常难以控制。鉴于此，使用传统的除菌过滤器（0.2μm孔径）对支原体实现完全截留。不可忽视的是，支原体的细胞大小为0.5-0.8μm，同时具有极大的灵活性和变形能力，能够通过除菌滤器。

支原体检测

检测支原体污染的方法有许多种。以生长法举例，在特定液体或固体的营养培养基中进行培养，或通过荧光显微镜的方式进行检测等都是非常普遍的方法。在目前的“金标准”里，生长检测需要至少有28天的培养时间，然后使用这些可用排除法确定并且缓慢生长的细菌进行污染。在此阶段中，样品必须要在白天可肉眼检测，而这也需要大量的时间。

即使采用荧光显微镜进行辅助检测，依然需要至少8天的时间来排除鉴定支原体的感染。另外，操作者需要经过专门培训，拥有丰富的经验，并知道特殊知识，才可有能力排除对结果的干扰。

“3-小时”替代法

基于PCR的检测试剂盒（如赛多利斯公司的Microsart®  AMP支原体试剂盒）可为用户提供灵敏、稳定的检测结果，耗时只需3小时。该方法简易且经济、试剂盒即取即用。试剂盒上仅需要一个能够检测荧光染料FAM和ROX的实时PCR仪即可。该PCR试剂盒适用于各种各样的初始样品。配合使用Vivaspin® 20或Vivaspin® 6超滤管，则可处理高达18ml的样品体积，从而确保高的灵敏度。
实验部分

下面所述的是一个使用Vivaspin® 20超滤管进行DNA分离并用Microsart® AMP进行支原体检测的案例。

将Mycoplasma fermentans于37℃在Hayflick培养基中进行培养，直至酚红指示剂颜色发生轻微的改变，然后将其用1xPBS（磷酸盐缓冲液）以1:1000的比例进行稀释。用移液器将18ml的稀释样品平均加入至每个Vivaspin® 20超滤管。为了中和非特异性化合物，在每份样品中添加2ml的包被缓冲液。然后以3500x g的转速离心20分钟，直至浓缩后的剩余体积约为200μl。在200μl裂解缓冲液的协助下，将全部浓缩物转移至一支新的1.5ml反应管中。缓冲液是用于冲洗Vivaspin® 20超滤管，以确保样品被完全彻底地转移。将200μl浓缩样品和200μl裂解缓冲液组成的混合物在56℃孵育15分钟，以促使细胞完全裂解。在该步骤之后，使用浓缩管将DNA分离。在DNA分离过程中，采用Microsart® AMP提取试剂盒，并根据试剂盒说明书进行操作。几乎全部分离的DNA都要用于实时PCR（60μlDNA洗脱液中的50μl），以达到最大的敏感度。

平行测试中，在不经过Vivaspin® 浓缩步骤的情况下，取相同初始量的DNA进行分离，以对经过浓缩和未经过浓缩的样品进行直接对比。

根据试剂盒说明书操作，PCR反应步骤如下：

 

l 将试剂盒中反应管与冻干成分一起以最大速度离心5秒，将1275μl的缓冲液添加至引物/探针/核苷酸混合物（红帽）中。

 

l 将300μl水（PCR质量级别）添加至阳性对照（绿帽）和内参对照（黄帽）中。

 

l 在室温下孵育5分钟，直至完全混合。

 

l 将溶液和Vortex混合物简单混合，并快速离心。

 

l 主混合物（Master Mix）的组成：每次均将49μl的引物/探针/核苷酸混合物（红帽）和1μl的内参对照（黄帽）进行反应，移液并混合至一支1.5ml的反应离心管中。

 

将50μl主混合物和50μl样品或阳性对照或阴性对照液（比如：洗脱缓冲液，PCR水，或者10mM Tris缓冲液）移液至200μl的PCR管中，并插入至经过预设程序的实施热循环仪中。

将浓缩样品的Ct值（循环阈值）与未浓缩样品持续进行比较。Ct值是当荧光信号达到某个设定的阈值时所经历的扩增循环数。表1列出了每一个Ct值。表2所示的是平均ΔCt值，即表1和使用或者未使用包被缓冲液样品之间的Ct值之差。ΔCt值的测定为：ΔCt-Ct（未经Vivaspin浓缩的样品）-Ct（浓缩样品）。

 

与包被缓冲液一起进行共同浓缩后，Mycoplasma fermentans可达到ΔCt>7的Ct差值。当没有使用包被缓冲液（个值未列出）时，记录的ΔCt值为稍低一点的6，尽管这一结果可能是由于Vivaspin® 超滤管的离心时间更短而造成的。不过，它仍然显示了在灵敏度上有了显著的提高。

 

灵敏度以及时间等参数对于支原体污染的调查而言是至关重要的。在浓缩步骤中，这些参数在PCR试剂盒中都会有详细描述。通过使用Vivaspin® 20，Ct值可提高到ΔCt>7，相应的灵敏度可以增加大约2 log的水平。这使得Microsart® AMP检测试剂盒和Vivaspin® 20能够成为经济、有效又实用的快速支原体检测工具

实验结果与讨论

使用TaqMan® 探针进行实时 qPCR 能够检测支原体的DNA，起始体积 200 μl -18 ml。通过qPCR 循环对样本DNA进行扩增，通过软件系统得到试验结果。