结晶紫法检测TNF的生物活性

　　TNF包括TNFα与TNFß两型，它们具有极其相似的生物学活性，在体内外可对一些肿瘤细胞或细胞系起杀伤作用，而对正常细胞则无细胞毒效应。根据这一特点，可利用TNF对敏感靶细胞的细胞毒效应，在体外检测TNF的活性水平，既可检测分泌型TNF(sTNF)，也可检测膜结合型TNF(mTNF)。最常用的方法是体外检测TNF对小鼠成纤维瘤细胞(L929细胞)的细胞毒效应。

　　【基本原理】

　　TNF对L929细胞有细胞毒作用，如同时加用转录抑制剂放线菌素D，则可提高L929细胞对TNF的敏感性10～100倍。利用染料结晶紫或MTT可使活细胞染色，再用脱色液将染料脱出，测定其OD值，即可反应细胞的存活状态或TNF对L929细胞的杀伤率，通过计算细胞死亡率，并与sTNF标准品对照，即可检测待测样品sTNF活性单位。

　　【材料和试剂】

　　(1)L929细胞株(存活率应>95%)

　　(2)TNF标准品：作倍比稀释(100U/ml～0.1U/ml)。

　　(3)待测样品：作倍比稀释至少6个不同稀释度。

　　(4)0.25%胰蛋白酶

　　(5)RPMI-1640培养液及PBS

　　(6)0.25%结晶紫(溶于20%甲醇中)，或者5mg/mlMTT(溶于PBS中)

　　(7)放线菌素D(分存液浓度为100ug/ml)

　　(8)柠檬酸钠缓冲液(0.9%柠檬酸钠，0.02mol/L盐酸，47.5%乙醇，为脱色液);酸化异丙醇(0.04mol/LHCL异丙醇)

　　(9)96孔细胞培养板，刻度吸管，毛细吸管，加样器(头)，刻度离心管，离心机，细胞计数板，倒置显微镜，超净工作台，CO2培养箱。

　　(10)酶标测定仪，570nm滤光片，630nm滤光片。

　　【操作步骤】

　　(1)取对数生长期的L929细胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗涤细胞2次，以去除消化液及原生长培养液;

　　(2)用RPMI-1640培养液调L929细胞浓度为2×105/ml;

　　(3)将上述细胞悬液加至96孔培养板，100ul/孔;

　　(4)置37℃，5%CO2培养箱中培养24h;

　　(5)吸去细胞培养上清液后，各孔分别加入倍比稀释的标准品和待测样品，100ul/孔，各设双复孔，并设培养液阴性对照及空白对照(即L929细胞、标准品及待测样品均不加入，仅加培养液);

　　(6)同时向各孔均加入10ul放线菌素D(0.5～1μg/孔);

　　(7)置37℃，5%CO2培养箱中培养12-14h;

　　(8)甩弃上清，并用RPMI-1640培养液洗细胞1次;

　　(9)每孔均加入0.25%结晶紫，100μl/孔，室温下染色10min;

　　(10)甩弃上清，再用PBS洗板3次;

　　(11)室温下凉干，加入柠檬酸钠缓冲液脱色，100μl/孔;

　　(12)充分混匀后，用酶标仪以检测波长570nm，参考波长630nm测各孔OD值。