抗体的提取纯化的方法和步骤

　　从免疫血清纯化抗体

　　1.剪取一小条0.45μm的硝酸纤维膜，置于1.5mleppendorf管中，浸没于1ml

　　1mg/ml的抗原溶液中，5min。

　　2.取出膜，置于滤纸上干燥。

　　3.将膜放置于装有1mlBufferA的eppendorf管，轻轻震荡混匀30min。

　　4.移去BufferA，用新鲜的BufferA洗一次，将膜浸没于0.8-1ml相应的抗血

　　清中，1-2h,于混匀器上轻轻震荡混匀。

　　5.移去血清，用PBS洗膜，4次，每次5min。

　　6.洗脱抗体

　　新配置100mM甘氨酸(pH2.5)抗体洗脱液，将膜置于洗液中，手轻摇

　　混匀2min，迅速将洗液转移至装有100μl1MTris(pH8.0)中和，使抗体

　　复性。第1次洗脱用400μl抗体洗脱液，第2，3次用200μl。

　　7.往洗脱下来的液体中加入100μlBufferA以稳定抗体，并分装成30μl每管，

　　于-20℃保存。

　　注：所有步骤均在室温完成。

　　精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使

　　用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。

　　一、盐析法

　　取xml血清加xml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。

　　↓4℃，3h以上，使其充分沉淀离心(3000rpm),20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。

　　↓置4℃3h以上，[此时，(NH4)2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02%mol/LpH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。

　　↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4 为止。

　　取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。

　　影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意(参阅本章第二节)。

　　二、冷酒精沉淀法

　　分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精(-20℃)到最终浓度为20%，保持在-5℃。产生的沉淀(A)，含有大多数种类的免疫球蛋白。沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/LNaCl溶液(冷)中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀(B)，包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液内。调节上清液的pH到7.4，加冷酒精(-20℃～-30℃)到最终浓度为25%，维持在-5℃。所得到的沉淀(C)含有90%～98%IgG。不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。从沉淀(B)可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀(B)悬浮在0℃水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01～0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在–2℃或-3℃低温，所得的沉淀(B-B)主要含IgA和IgM。

　　表2-5从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件

　　物种pH沉淀条件IgG产量

　　酒精浓度(%)离子强度

　　人5.115.0.0165

　　山羊5.200.0165

　　家兔5.2100.0170

　　大鼠5.0150.0150

　　豚鼠5.1150.0170

　　三、DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白

　　原理：DEAE-SephadexA-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50)为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH6.85～7.5)，其余均属酸性蛋白。PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析，γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG.

　　(一)操作步骤

　　1.DEAE-Sephadex

　　A-50预处理称DEAE-SephadexA-50(下称A-50)5g，悬于500ml蒸馏水内，1h后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH15ml的比例，将A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性;再以0.5mol/LHCl同上操作过程处理，最后以0.5mol/LNaOH再处理一次。处理完后，将A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中过夜。

　　2.装柱

　　(1)将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。

　　(2)将0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。等A-50。等A-50凝胶沉降2～3cm高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。

　　(3)关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。

　　3.平衡

　　启开出水口螺旋夹，控制流速12～14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。

　　4.加样及洗脱

　　启开上口橡皮塞入下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积2%，蛋白浓度以<100mg为宜)。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2～3次;再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12～14滴/min。

　　5.收集

　　开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。

　　6.测蛋白

　　以751型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm,与OD260nm,按公式计算各管蛋白含量。并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。

　　7.合并、浓缩

　　将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG(MW6000)浓缩至所需体积，加入0.02%NaN3防腐，于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。

　　8.A-50凝胶的再生

　　在柱上先以2mol/LNaCl洗脱蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存;近期不用时，以无水酒精洗2次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。

　　(二)注意事项

　　(1)柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。

　　(2)纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。

　　(3)所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。

　　(4)洗脱过程中应严格控制流速，切勿过快。

　　(5)上样的体积要小，浓度不宜过高。

　　(6)加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。

　　四、SPA-SepharoseCL-4B亲合层析纯化

　　IgG及IgG亚类

　　(一)原理

　　葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-SepharoseCL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。

　　(二)操作步骤

　　用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶，(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)。

　　↓

　　装柱后用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液平衡。标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤，上样前用1mol/LpH9.0Tris液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜。

　　↓

　　加样，一般按25～30mgIgG/g湿胶比例加样，室温作用15min，用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液充分淋洗，到淋洗液OD值为<0.02。

　　↓

　　用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH6.0;纯IgG2a用pH4.0;纯化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl缓冲液洗脱。

　　↓

　　用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。

　　↓

　　收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。

　　(三)试剂器材

　　(1)SPA-SepharoseL-4B(pharmacia)

　　(2)磷酸缓冲液0.1mol/LpH8.0 0.02%NaN3

　　(3)枸橼酸缓冲液0.1mol/LpH6.00.1mol/LpH4.0 0.02%NaN30.1mol/LpH3.0

　　(4)1mol/LpH9.0Tris溶液

　　(5)再生缓冲液：①0.1mol/LTris含0.5mol/LNaCl调整pH至8.5 0.02%NaN3;②0.1mol/L醋酸钠含0.5mol/LNaCl调整pH至4.5 0.02%NaN3。

　　(四)注意事项

　　(1)SPA-SepharoseCL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。方法：先用10倍柱体积0.1mol/LpH8.5Tris含0.5mol/LNaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白;再用10倍柱体积0.1mol/LpH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/LNaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白;0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。

　　(2)SPA-SepharoseCL-4B亲合层析法还可用于：①除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体(如IgM)的生物学活性;②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段;③吸收或纯化免疫复合物。

　　(3)狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。

　　五、高效和液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体

　　从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。应用TSKDEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物学活性。

　　(一)原理

　　根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗

　　脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。

　　(二)操作步骤

　　腹水离心10000g,10min，除去细胞和杂质，在4℃下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40%饱和硫酸铵

　　↓搅拌20～30min

　　离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A(pH8.5,

　　20mmol/LTris缓冲液)透析除盐

　　↓4℃过夜

　　用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK

　　DEAESPW离子交换层析柱

　　↓

　　洗脱流速1ml/min

　　0～1min：0→5%缓冲液B(20nmol/L

　　Tris,Ph8.5,含2.0

　　mol/L醋酸钠)

　　1～2min(线性梯度洗脱)：5→20%缓冲液B

　　20～22min：20→0%缓冲液B

　　↓

　　洗脱液用紫外280nm进行监测

　　↓

　　收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定

　　(三)试剂和器材

　　(1)TSK

　　DEAESPW离子交换层析柱(75mm×7.5mm,Bio

　　Rad)

　　(2)高效液相色谱仪(包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统)

　　(3)PBS，缓冲液A和B。

　　(四)注意事项

　　(1)所用缓冲液和加样粗提物均需0.2μm滤膜过滤。

　　(2)在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb

　　的存留时间(retention

　　time)有所差异。

　　【附录】

　　制备单克隆抗体常用的试剂

　　1.RPMT-1640培养液其中含2mmol/L谷氨酰胺，25

　　mmol/LHepes,5×10-5mol/L

　　RPMT-1640完全培养液上述溶液加10%～20%灭活小牛血清

　　3.HT母液×100

　　次黄嘌呤(H)

　　1.0×10-2mol/L

　　136.1mg

　　胸腺嘧淀核苷(T)1.6×10-3mol/L38.8mg

　　蒸馏水100ml

　　4.A母液×100

　　氨基喋呤(A)4×10-3mol/L

　　1.76mg

　　蒸馏水90.0ml

　　1mol/LNaOH0.5ml

　　溶解后,加1mol/L

　　HCl0.5ml,再补加蒸馏水至100ml。

　　5.HAT选择培养液

　　RPMI-1640培养液

　　80ml

　　灭活小牛血清20ml

　　HT母液×100

　　1ml

　　A母液×100

　　1ml

　　用5%NaOH调节pH至7.4左右。

　　6.HT培养液

　　RPMI-1640培养液

　　80ml

　　灭活小牛血清

　　20ml

　　HT母×100

　　1ml

　　用5%NaOH调节pH至7.4左右。