免疫组化问题解答

　　1 染色过强

　　原因 解决方法

　　a 抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜

　　b 孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度

　　c DAB显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准

　　2 非特异性背景染色

　　原因 解决方法

　　a 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3次每次5分钟

　　b 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长

　　c 组织中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭

　　d 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间

　　3 染色弱

　　原因 解决方法

　　a 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少 于60分钟

　　b 试剂超过有效使用时间 应更换试剂

　　c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液

　　使试剂稀释 (应防止切片干燥)

　　d 室温太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜

　　e 蛋白封闭过度 封闭不要超过12分钟

　　4 染色阴性

　　原因 解决方法

　　a 操作步骤错误 应重试 设阳性对照

　　b 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果

　　c 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误