单核细胞分离原理、方法及要点

　　单核细胞分离原理、方法及要点:

　　基本原理：本文分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法，主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。此法易操作，且使用通常的实验设备即可完成。

　　试剂与器材

　　1)外周血单个核细胞

　　2)1×PBS和10×PBS(无Ca2+、Mg2+，0.5mM EDTA)，胎牛血清(56℃，30分钟加热灭活)，HCl1mol/L。

　　Percoll分层液(密度=1.130g/ml,商品)，4g/L台盼蓝染液(溶解在PBS液中)。

　　3)50ml聚丙烯圆锥管，毛细吸管，移液管(1、2、10ml)。

　　4)CO2孵箱，超净台，有旋转桶转子装置的离心机，PH计。

　　操作步骤——所有的操作应该在无菌条件下进行

　　(一)不同密度Percoll分层液的配制

　　1.Percoll分层液储备液的制备：取未稀释的Percoll原液(从瓶中取)9ml+1ml 10×PBS(无Ca2+、Mg2+)，用HCl 调节PH至7.4

　　2. Percoll分层液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)的配制：取Percoll储备液3.12 ml(前一步配制)+1.88ml 1× PBS1(无Ca2+、Mg2+)

　　3. Percoll分层液 (Ⅱ)(密度=1.069g/ml)的配制：取Percoll分层液(Ⅰ)2.68 ml+2.32ml1×PBS( 无Ca2+、Mg2+)

　　4. Percoll分层液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)的配制：取Percoll分层液(Ⅱ)2.32 ml +2.68 ml1×PBS(无Ca2+、Mg2+)

　　(二)不连续密度梯度制备

　　1.将洗涤过的8×107外周血单个核细胞重新悬浮在2ml的Percoll分层液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)在这层液体的表面上轻轻铺上2mlPercoll分层液(Ⅱ)(密=1.069g/ml)，后再于第二层液面上轻轻铺上2ml的Percoll分层液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)

　　2. 20℃，在旋转转子中1000×g离心上步所形成的密度梯度90分钟(慢慢增加速度，无制动停转)。

　　(三)单核细胞的分离

　　1. 离心后单核细胞存在于Percoll分层液(Ⅱ)和(Ⅲ)(密度较小的部分)之间的界面中。

　　2. 用毛细吸管仔细收集单核细胞。

　　3. 用含1-5%胎牛血清的 1×PBS液洗涤细胞3次，4℃，400×g离心5分钟，弃上清液。

　　4. 若需要进一步实验，将细胞重新悬浮于培养基中。

　　5. 用台盼蓝拒染法测定细胞存活率。

　　结果：本法回收的细胞中单核细胞占70-100%(存活率应大于90%)，淋巴细胞占0-20%，粒细胞占0-5%，红细胞占0-7%，血小板小于0.5%。

　　实验要点

　　1.为了得到较好的结果，外周血单个核细胞分离后应立即使用。

　　2.所有操作过程应在18-20℃中进行。

　　3.仔细覆盖各种Percoll分层液，避免破坏其界面。

　　4.洗涤分离细胞3次，以除去残存的Percoll分层液和血小板。

　　5.如果所制备的细胞仍不纯，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗体分子的磁珠，以除去残存的NK、T、B淋巴细胞。