蛋白质比色定量方法

　　传统标准的BCA 蛋白定量分析方法常规均使用试管或者微孔板进行检测，通过对传统方法进行改进，可使用Take3™ 超微量检测板进行原位微量BCA法蛋白定量分析。待测蛋白样品和BCA 工作缓冲液按照顺序直接加在Take3™板的微量定量孔处、温浴，使用Epoch™ 微孔板分光光度计进行检测。和传统标准BCA 方法(BCA 工作缓冲液和蛋白质样品体积比为20：1)相比，该方法的蛋白检测灵敏度有明显的提高。相比Mini-BCA 分析法，该分析方法更加精确。

　　BCA 法是十分常用的蛋白质比色定量方法，很多试剂供应商都提供基于比色皿和微孔板的BCA 蛋白定量试剂盒。BCA蛋白定量法相对于其它比色定量法具有操作简单、稳定、灵敏度高等优点。相对于蛋白质固有的280nm 吸收峰检测，BCA 检测法提高了蛋白检测灵敏度和特异性，消除了核酸的干扰，核酸干扰在对细胞裂解物或其他生物样品进行蛋白定量时总是一个难以避免的干扰。在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+, Cu+ 与BCA 试剂形成紫色络合物，如图1. 其吸光值与蛋白浓度成正比。测定在562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

　　材料和方法

　　BCA 检测试剂盒及小牛血清 (BSA) 。我们使用两种实验方法来进行BCA 检测。

　　第一种方法是按照NanoDrop 技术手册推荐的“Mini-BCA”法。其简要流程是：BCA 检测系统混合好的10uL BCA 工作缓冲液和10uL 的标准蛋白或待测的10uL 样品(1：1)在试管中混匀，37℃温浴30 分钟后进行检测。

　　第二种方法是使用Take3超微量多体积检测板进行原位检测。其简要流程是：直接按照顺序滴加2uL 标准蛋白或样品，然后再滴加2uL BCA 工作缓冲液到Take3 板的检测孔上，标准蛋白和检测样品每个2 份，室温(~22℃)孵育25 分钟后进行样品的定量检测。

　　所有DNA 检测均使用空白矫正。信噪比(S/N)通过每孔平均荧光信号的标准差扣掉空白值来确定。标准曲线采用线性回归方程。

　　板布局给出BSA 标准蛋白的位置和浓度以及多达四个未知浓度标准品。这个布局提供了6个标准蛋白浓度点用于制作标准曲线，这6个点位于A-F行，每个点有两个重复，浓度范围为0.01-1.0mg/mL，还有4 个检测孔用于放置未知样品，位于G、H 行。原位BCA 法和Mini-BCA 法都是用这种布局，来比较试验的准确性。

　　空白对照是1：1 体积的BCA 工作缓冲液和去离子水。BCA法蛋白定量的检测波长为562nm。BSA 的实际浓度是使用Take3 和1cm 标准光程的BioCell 石英比色杯在Epoch 分光光度计上检测得到的。