融合蛋白的免疫筛选实验

实验材料    大肠杆菌 
试剂、试剂盒    LB顶层琼脂糖叠氮钠第一抗体 
仪器、耗材    硝酸纤维素滤膜 
抗体    CD2抗体 
山羊Lambda Light Chain多克隆抗体 
山羊Complement C4多克隆抗体 

实验步骤：     
1. 在150 ml LB平板上滴定λgt11 cDNA文库的滴度，宿主菌为大肠杆菌LE392菌株，每个平板使用7 ml 1%LB顶层琼脂。 
2. 选择适当的滴度铺平板，于37℃温育8h。 
3. 将直径132 mm硝酸纤维素滤膜分别编号，放入上述已培养8 h的平板中，于37℃温育。 
4. 用针头刺孔并用印度墨汁在每张滤膜上作一标记，然后取出滤膜。 
5. 在室温用免疫筛选缓冲液洗膜30 min，以封闭滤膜并洗去膜上的残留细菌，重复洗涤2~4次。 
6. 将第一抗体（稀释于免疫筛选缓冲液中，终浓度为0.5~10 μg/ml）加到装有滤膜的塑料袋中，热封口后置40℃水平摇床上反应2~24h。 
7.  于4℃用免疫筛选缓冲液洗膜4~5次，毎次5~10min。 
8.  接着将125I 标记的第二抗体（0.5×106cpm/ml）加入装有滤膜的热封塑料袋中，4℃反应2~6 h。 
9.  在4℃用免疫筛选缓冲液洗膜4~5次，然后用滤纸将滤膜上的液体吸干。 
10.  用塑料保鲜膜包裹好滤膜，使用增感屏在-70℃对X光片曝光。 
11.  通过反复稀释，纯化λ噬菌体cDNA融合蛋白克隆，最终获得单一的阳性克隆。 
12.  培养阳性克隆，制备重组λ噬菌体DNA。 

IPTG法 
实验方法原理：用抗体筛选λgt11 cDNA文库时，可待噬斑长到一定裎度方可诱导表达融合蛋白，筛选到阳性克隆的成功概率就可能大大增加。噬菌体生长3~4 h后，将含诱导剂IPTG的滤膜放入噬斑平板，即可诱导β-半乳糖苷酶-cDNA融合蛋白的表达，继续在37℃培养，然后按基本方案用抗体对影印滤膜进行筛选。 

实验材料    大肠杆菌 
试剂、试剂盒    IPTG 
仪器、耗材    培养箱牙签硝酸纤维素膜 
抗体    CD2抗体 
山羊Lambda Light Chain多克隆抗体 
山羊Complement C4多克隆抗体 

实验步骤     
1.  用1×104~5×104融合有cDNA的λ噬菌体感染0.5~1.0 ml 培养的Y1090新鲜菌悬液。 
2.  加入预热到47℃的7 ml 顶层琼脂中，铺150 mm LB平板，42℃培养3.5 h。 
3.  将132 mm 直径的硝酸纤维素滤膜故入10 mmol/l IPTG溶液中浸泡后，取出干燥。 
4.  再将含IPTG的滤膜放入噬菌体文库平板中，37℃培养3.5 h。 
5.  每张滤膜作好标记后取出，封闭滤膜上的剩余的蛋白结合位点并进行杂交检测。