细胞免疫形态学检测法

　　一些淋巴细胞，如CTL、NK、LAK等对靶细胞具有直接的杀伤作用，可以根据待检测的效应细胞的性质选用相应的靶细胞，如肿瘤细胞、移植供体细胞等，可用于肿瘤免疫、移植排斥反应、病毒感染等方面的研究。免疫效应细胞毒实验是在组织培养中研究淋巴细胞、抗体或抗体依赖性淋巴细胞杀伤靶细胞的一种技术，也是在体外研究特异性细胞免疫比较可靠和灵敏的方法，检测方法有形态法、放射性同位素法、乳酸脱氢酶释放法、MTT法、流式细胞仪法等。

　　形态学检测法（以CTL为例）
　　（一）原理：形态学检查法是根据体外贴壁生长的靶细胞被CTL杀伤后失去贴壁的能力，所以从贴壁细胞数目减少情况可判断CTL杀靶细胞的能力。形态学方法不需要特殊设备，仅用显微镜计数靶细胞的存活数，操作方便。

　　（二）材料
　　1．新鲜的外周（肝素）抗凝血液。
　　2．靶细胞（通常选用传代的肿瘤细胞如K562）。
　　3．RPMI 1640培养液、PBS缓冲液。
　　4．96孔酶联免疫塑料板、微量试验板。

　　（三）方法
　　1．靶细胞的接种用RPMI 1640培养液将肿瘤细胞培养物制成悬液，并稀释1×103／ml的细胞浓度。于微量试验板的小孔内分别接种0.1 ml肿瘤细胞（内含1。。个细胞），5％CO 237℃孵箱培育24h。细胞贴壁后，轻轻弃去培养基，加1ml PBS洗涤，轻去洗涤液及未贴壁细胞。
　　2．淋巴细胞分离液制备PBMC
　　（1）将4ml分层液置试管下层，然后将抗凝血（1ml静脉血与1ml肝素混匀，再用Hank’s液对倍稀释）轻轻铺于分层液上，使分层良好。
　　（2）用水平离心机2000r／min离心20min，用毛细吸管将单个核细胞吸出，并用Hank’s液洗涤3次，每次1500r／min离心10min，取悬液0．1ml加等量血细胞稀释液，计数，最后配成（2～4）×105／ml的细胞悬液。
　　3．细胞毒性反应
　　（1）淋巴细胞与肿瘤细胞反应：向小孔分别加入0.2ml不同浓度的淋巴细胞（分别含有5×105，5×104，5×lO3），使淋巴细胞与癌细胞之比依次为1000：1、l00：1、lO：1。
　　（2）每小孔补加含20％NCS的RPMI 1640培养液O．1ml，5%CO2 37℃孵箱培育2～3d。
　　（3）2％台盼蓝染色，翻转微量试验板，计数活存的肿瘤细胞，并设正常人淋巴细胞代替肿瘤患者淋巴细胞作对照，每份需同时做3个复孔，分别检查各孔中存活细胞数，计算各孔平均残留细胞数，便可求出淋巴细胞对肿瘤细胞生长的抑制率（即细胞毒性）。

　　（四）结果分析：镜检计数每孔底残留的细胞数，以抑制率表示。