药敏实验方法

　　1.实验材料：

　　1.1培养基：如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦康凯培养基，做沙门氏菌可选择SS培养基，巴氏杆菌可选择血液琼脂。

　　1.2药敏试纸：购买、自制或厂家提供

　　1.3细菌：从病鸡病变部位提取，如肝脏、心脏、脾脏等脏器。

　　1.4接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯

　　1.5移液器、滴头

　　2.实验准备：

　　2.1药敏片的准备：自制

　　2.1.1药敏片的制备：取定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片，取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎，经15磅15-20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。

　　2.2.2抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液适量，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密封，切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3-6个月。

　　2.2药液的制备(用于商品药的试验)：按商品药治疗量3-5倍比例配制药液;如治疗量为1L水加1g药，配制药液时就是1g加200-300ml水或1L水加3-5g药，及配制药敏片所用的药液。

　　3.实验操作方法：

　　3.1药敏片法

　　3.1.1在“超净台”(或自制无菌操作台)中，用(酒精灯)经火焰灭菌的接种环从病料中挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式：用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2，然后找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。(另：可将待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，将少量混悬液倒入平皿培养基上，轻晃平皿使铺匀，放置5-10min)。

　　3.1.2将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上，一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片(外周一般可贴4-5片)，每种药敏片的名称要记住。

　　3.1.3将平皿培养基倒置放于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

　　4.结果观察：

　　在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。

　　5.判定标准：

　　5.1药敏实验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。

　　表1 药物敏感实验判定标准

　　抑菌圈直径(毫米)　敏感度

　　20以上极敏

　　15-20高敏

　　10-14中敏

　　10以下低敏

　　0 不敏

　　5.2 药物敏感实验判定标准参考表1，抑菌圈直径在15毫米以上为高敏，10毫米以下为低敏，无抑菌圈为不敏。

　　6.影响药敏结果的因素：

　　6.1培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适(约5-6mm)，不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸(PABA)能拮抗磺胺药和TMP的活性。

　　6.2细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。

　　6.3药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。

　　6.4培养时间：一般培养温度和时间为37℃、12-24小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。

　　7.应用

　　药敏实验后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助使用，以减少耐药菌株。选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，因为我们药敏实验是药液直接和细菌接触，而在给禽用药的时候，必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果，所以在给禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，这样才会达到好的治疗效果。

　　附表2 山东省2004年1-5月份大肠杆菌和沙门氏菌常用药物敏感程度参考表

　　药物 大肠杆菌 (细菌)沙门氏菌(细菌)

　　QD-1(菌株)LC-5JN-7LY-1RZ-5QD-2JN-8LY-1

　　新霉素20(抑菌)18142526231816

　　先锋必2826302932333126

　　氟苯尼考2221141830282421

　　庆大霉素15001219171212

　　诺氟沙星1012131220201121

　　氧氟沙星1213131123221512

　　先锋五号1923201828262122

　　蒽诺沙星1214151320161316

　　丁胺卡那17191222323014